制备牛蒡寡糖脂质体并对其性质进行检测

制备牛蒡寡糖脂质体并对其性质进行检测

发布时间:2022-08-08 07:40:09 来源:正规华体会官网 作者:华体会网页版登录

内容简介:  牛蒡寡糖为一种水溶性、菊糖构型的低聚果糖,可从牛蒡(Arctium lappa L.)根中提取 , 是一种传统的药食同源菊科植物,具有多种药理活性。 研究发现,牛蒡寡糖不仅具有免疫抑制和生物调节功能, 同时作为一种果寡糖, 还可以改善血脂,降低血压和血糖。 但是由于消化道分解和小肠粘膜细胞对其吸收有限,使这种低聚果糖不能有效发挥生物学功能。 因此探讨一种新的药物剂型来丰富其给药途径,对牛蒡寡糖的应用具有重要意义。  脂质体是近年来备受科研和临床关注的一种新的药物剂型,丰富了药物的给药方式。脂质体的口服可以避免因胃酸对药物的分 解而...
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  牛蒡寡糖为一种水溶性、菊糖构型的低聚果糖,可从牛蒡(Arctium lappa L.)根中提取 , 是一种传统的药食同源菊科植物,具有多种药理活性。 研究发现,牛蒡寡糖不仅具有免疫抑制和生物调节功能, 同时作为一种果寡糖, 还可以改善血脂,降低血压和血糖。 但是由于消化道分解和小肠粘膜细胞对其吸收有限,使这种低聚果糖不能有效发挥生物学功能。 因此探讨一种新的药物剂型来丰富其给药途径,对牛蒡寡糖的应用具有重要意义。

  脂质体是近年来备受科研和临床关注的一种新的药物剂型,丰富了药物的给药方式。脂质体的口服可以避免因胃酸对药物的分 解而导致的疗效降低;而且通过静脉给药,也能利用脂质体对富含免疫细胞的脏器如淋巴、肝、脾等的被动靶向性,而更好地发挥免疫调节作用;除此以外,它还具有减少用药剂量、降低毒性、延缓释放等优点。本课题组将分离得到的牛蒡寡糖纯品(BOS-2)作为包封药物, 分别采用两种不同的方法制备脂质体, 并进行了高压均质处理, 得到了满足过滤除菌及临床静脉注射需要的小粒径脂质体。 通过脂质体主要性质,如粒径和包封率等的检测, 选择出了一种较好的制备方案,为牛蒡寡糖脂质体的大量制备、生物活性研究、体内实验及临床应用等奠定了基础。

  大豆磷脂(PC,含量90%),胆固醇(CH),牛蒡低聚寡糖(本实验室提取纯化),葡萄糖标准品;

  旋转蒸发仪,SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵,超声波清洗器,Helios-γ紫外-可见光分光光度计,微射流超高压均质机(苏州微流纳米生物技术有限公司),PSS激光粒度仪(苏州微流纳米生物技术有限公司),JEM-2100高分辨电子显微镜等。

  精密称取干燥至恒重的定量无水葡萄糖,用pH=7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)配制成0.2mg/mL的标准溶液,量取2mL,加入1mL5%苯酚试剂,并迅速滴加浓硫酸5mL,充分混匀,放置5min,后置沸水浴中加热15min,取出放置20min。同时,用PBS同法操作,作为参比;所用辅料为空白对照。之后在300~700nm波长之间进行扫描,以确定葡萄糖的体外测定波长。结果葡萄糖在488nm处有最大吸收峰,而对应的溶剂辅料无吸收干扰,故确定488nm为葡萄糖体外测定波长。准确配制一系列浓度的标准待测液,并按照上述“苯酚-浓硫酸”法处理,以PBS为空白参照,在所确定的波长下测定吸光度值(A)。以浓度C(mg/mL)对OD值进行线性回归 ,求出标准曲线;n=3)。结果表明在葡萄糖浓度为0.005至0.15mg/mL(即 5-150μg/mL)的区间内,线 回收率和精密度测定

  配制低、中、高浓度的葡萄糖标准溶液,分别为 20、60、100μg/mL,在1d内测定5次和5d内测定5次浓度值,将测得的浓度值和配制的浓度相比较, 计算其回收率以及日内和日间精密度RSD。 结果表明,其回收率达到99%,日内和日间精密度 RSD3%,见表 1。

  精密称 取干燥至恒重的牛蒡寡糖,配制成0.1mg/mL的溶液,按照“2.1”项方法处理,紫外分光光度法测定OD值,并计算其寡糖溶液中葡萄糖的浓度C。则换算因子f=C′/C。其中C′为所配制牛蒡寡糖浓度值。 结果计算出牛蒡寡糖溶液换算因子f为1.28。

  为获得最佳脂质体制备方案 ,本实验以包封率为参考,对卵磷脂和胆固醇的比例、有机相和水相的种类及比例、旋转蒸发温度以及高压均质等条件都做了优化,从而筛选出一套最优制备方案:卵磷脂与胆固醇的质量比为4:1;有机相为氯仿,水相为PBS(pH=7.4),两者体积比为1:2;旋转蒸发温度为37℃;均质条件为800bar,3个循环。

  按筛选的处方精密称取一定量的大豆磷脂和胆固醇,溶于氯仿并置于梨心瓶中,37℃旋转蒸发,使脂质均匀成膜,并继续抽干以除去痕量有机溶剂。之后加入一定量的牛蒡寡糖溶液,使脂质膜完全脱落转入水相,充分溶胀、水合,得到粗制的大多室(MLV)牛蒡寡糖脂质体悬液。同时以PBS代替上述牛蒡寡糖溶液进行相同操作 ,得到空白脂质体。再将得到的MLV脂质体稀释10倍,微射流超高压均质机(苏州微流纳米生物技术有限公司)处理,得到小单室(SUV)脂质体悬液。

  微射流超高压均质机(苏州微流纳米生物技术有限公司)配置好大豆磷脂和胆固醇的氯仿溶液,置于梨心瓶中,加入牛蒡寡糖溶液,超声乳化至形成均匀稳定的W/O型乳剂。然后37℃旋转蒸发,待形成类白色胶状物,再加入一定量的 PBS,旋转脱胶,得到大单室脂质体(LUV)。空白脂质体即是用PBS代替上述牛蒡寡糖溶液进行同样操作。之后,同样方法得到小单室(SUV)脂质体悬液。

  取制备好的脂质体样品适量,根据要求稀释数倍后,用3%磷钨酸负染,滴至铜网上,自然挥干后用透射电子显微镜观察并拍摄照片。结果见图1,结果表明,本实验制备的牛蒡寡糖脂质体为粒径均匀的球状或近球状小囊泡。

  取牛蒡寡糖脂质体适量,用PBS液稀释后,用微电泳仪测得其Zeta电势为-12.56mv。这为脂质体在胶体力学上的稳定性提供了可能。

  取两种方法制备的牛蒡寡糖脂质体,经220μm滤膜过滤后,用激光粒度分析仪进行测定,并用动态光散射处理软件处理,结果显示,两种方法制备的脂质体粒径分布如图2所示,薄膜分散法制备的脂质体平均粒径为74.2nm,分散系数为0.582;逆相蒸发法制备的脂质体平均粒径为68.8 nm,分散系数为0.608。两种方法制备的脂质体粒径均在40nm至300nm的范围,达到均质的目的。

  本实验试采用超滤-紫外可见分光光度法进行包封率的测定。取5mL制备好的脂质体,用30kD截留分子量的超滤管进行离心,取下层液体,用‘苯酚-浓硫酸’法测定牛蒡寡糖含量C,并计算包封率E(E=(1-C/C总)×100%)。其中n为实验次数,C总为牛蒡寡糖总浓度。结果见表2。

  由表2知,在高压均质前,薄膜分散法制备的牛蒡寡糖脂质体包封率略低,这也证实了逆向蒸发法的优越性;但在微射流超高压均质机(苏州微流纳米生物技术有限公司)均质后,逆向蒸 发法 制备的脂质体包封率急剧降低,而薄膜分散法制 备的脂质体下降不大,因此,我们选择薄膜分散- 高压均质法制备牛蒡寡糖脂质体,并将对其稳定 性进行实验研究。

  将制备好的牛蒡寡糖脂质体分成两份,分别置于室温和4℃冰箱中储存,分别于5、10、15、30、60d观察其形态变化,并用超滤-紫外可见分光光度法测定其包封率E及渗透率P(P=C/C包×100%,C包为脂质体包封寡糖浓度)的变化,确定其稳定性。其渗透率变化结果见图3,包封率变化结果见图4。

  脂质体的渗透率和包封率变化曲线指出,牛蒡寡糖脂质体在4 ℃下储存稳定性较室温储存好,且其包封率下降呈现一定的S形曲线附图),脂质体的包封率在20d之后发生较大程度的下降,同时还伴随着脂质体悬液中大量聚沉现象的发生。而对于室温下储存的牛蒡寡糖脂质体,其包封率呈现直线下降的趋势,脂质体分散体中很早就出现脂质聚沉。

  脂质体制备方法很多,考虑到将来大量制备的需要,本实验选用逆相蒸发法和薄膜分散法。一般而言,前种方法制备的多为大单室脂质体(LUV),而后种方法制备的多为大多层脂质体(MLV)。对于水溶液药物来说,逆相蒸发法制备的脂质体包封率通常更高,本实验结果与此相符。但高压均质处理后,脂质体粒径变小的同时,LUV脂质体包封率也下降的程度也较大,可能是LUV脂质体在高压均质时易受破坏,而MLV脂质体层数多,主要由小囊泡聚集形成,受高压均质破坏的程度相对较小。因此薄膜分散法更适合于牛蒡寡糖脂质体的大量制备,该法均质后获得的牛蒡寡糖脂质体平均粒径为74.2nm、包封率较高(45.55%),能够满足过滤除菌及进一步体内实验的要求。

  包封率是评价脂质体质量好坏的重要指标,一般采用的测定方法包括葡聚糖凝胶层析法,超速冷冻离心法,透析法,微柱离心法,鱼精蛋白凝聚法等。本实验根据牛蒡寡糖低分子量(约为2134)的特点,我们选择合适截留分子量的超滤管,通过离心超滤法,可将脂质体和游离的牛蒡寡糖分离开来,操作简单易行,而且无需昂贵的实验器材,方便实用。

  脂质体的稳定性对脂质体的后期实验和临床运用具有重要的作用,由所测的Zeta电势值(-12.56 mv)可以看出制备的牛蒡寡糖脂质体稳定性较好。另外通过考察不同保存温度下脂质体的渗透率及包封率变化,发现4℃时保存的稳定性明显好于常温,其包封率呈现S型曲线的下降趋势,说明脂质体在一定时间段内比较稳定,之后会发生快速下降,这可能是由于磷脂的氧化水解、脂质聚集、脂质融合等达到一定程度后造成的。室温下脂质体的包封率呈现直线下降的趋势,这可能是因为温度高(接近相变温度),磷脂本身不稳定,脂质体囊泡聚集速度快等因素的缘故。因此,保存温度对于寡糖脂质体的性质影响很大,在大量制备时需要充分考虑这一点。在进一步的实验中,实验组将就该脂质体的体外、体内(口服和注射)药物释放进行分析,并对其生物学活性进行研究。

  总之, 本实验通过薄膜分散-高压均质法得到了粒径大小适宜,包封率较高且4℃储存稳定性较好的牛蒡寡糖脂质体。这不仅为下一步将要进行的体内外生物学活性研究奠定了基础,且为大量制备粒径较小、包封率较高及稳定性较好的寡糖类乃至可溶性药物脂质体提供了有益的参考。另外文章中提到的“超滤管-紫外分光光度法”也为包封率测定提供了一种新的方法。

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